Wytwarzanie produktów o najwyższej jakości jest warunkiem koniecznym, zwłaszcza w takich przemysłach jak farmaceutyczny, czy spożywczy. To wymaga dokładnych, powtarzalnych oraz prostych metod, które są w stanie maksymalnie ograniczyć potencjalne błędy ludzkie. Miareczkowanie automatyczne jest jednym z rozwiązań, które oferuje oszczędność w zakresie czasu oraz kosztów eksploatacji w laboratoriach.
Po wprowadzeniu automatyzacji metod miareczkowych, pojawia się pytanie jak możesz zagwarantować, że dana metoda jest w stanie dostarczać rzetelnych wyników? Skąd wiesz, że akurat ta metoda jest odpowiednia do analizy danego parametru czy analitu? To sprawia, że dana metoda wymaga zwalidowania, które obejmuje m.in. mianowanie (standaryzację) odczynnika miareczkującego (titranta), ale również wyznaczenie dokładności, precyzji, liniowości oraz specyficzności metody.
Monografia farmakopei amerykańskiej USP General Chapter <1225> Validation of Compendial Procedures and ICH Guidance Q2(R1) Validation of Analytical Procedures opisuje wszystkie wymagania w zakresie walidacji metod, których najistotniejsze elementy są poruszone w niniejszym artykule, a także w białej księdze dostępnej pod linkiem:
https://www.metrohm.com/pl_pl/applications/whitepaper/wp-068.html
Najważniejsze parametry walidacyjne to:
Standaryzacja
Rozcieńczanie, błędy ważenia, a także stałe starzenie się wszystkich titrantów wpływa na zmianę ich stężenia. W celu uzyskiwania rzetelnych wyników konieczne jest zadbanie, aby titrant używany do miareczkowania miał dokładnie znane stężenie. Dlatego też standaryzacja (wyznaczanie miana) jest integralną częścią walidacji metod miareczkowych. Procedury traktujące o wyznaczaniu miana różnych titrantów używanych do miareczkowania są opisane w sekcji pt. „Volumetric Solution” w monografii USP, ale również w biuletynie aplikacyjnym Metrohm AB-206. (https://www.metrohm.com/pl_pl/applications/ab-application-bulletins/ab-206.html)
Titrant używany podczas walidacji musi być w pierwszej kolejności poddany mianowaniu z wykorzystaniem stałego wzorca lub innego roztworu mianowanego. Ważne jest, aby etap mianowania oraz analiza próbki odbywały się w tej samej temperaturze.
Wzorce używane do mianowania powinny mieć następujące właściwości:
- wysoką czystość oraz stabilność,
- niską higroskopijność (minimalizacja wahań masy),
- wysoką masę cząsteczkową (minimalizacja błędów ważenia)
W celu oceny dokładności poleca się zastosowanie pierwszorzędowego wzorca.
W celu uzyskania większej ilości informacji na temat wyznaczania miana, polecamy niżej wymienione, bardziej szczegółowe opracowania:
Co należy wziąć pod uwagę przy standaryzacji titranta? (https://www.metrohm.com/pl_pl/aktualnosci/blog/20-21/what-to-consider-when-standardizing-titrant.html)
Miano titranta w miareczkowaniu Karla Fischera (https://www.metrohm.com/pl_pl/aktualnosci/blog/20-21/oznaczanie-miana-w-miareczkowaniu-karla-fischera.html)
Dokładność i precyzja
Dokładność jest definiowana jako zbieżność wyniku z prawdziwą wartością. W związku z tym dostarcza informacji o błędzie systematycznym. Dokładność należy wyznaczyć w całym zakresie stężeń.
Precyzja jest zazwyczaj wyrażana jako odchylenie standardowe (SD) lub względne odchylenie standardowe (RSD). Określa stopień zgodności pojedynczych wyników w ramach analizy homogenicznej próbki. Ważne jest to, że precyzja bierze pod uwagę nie tylko etap analizy, ale również wszystkie etapy związane z przygotowaniem próbki, które powinny być wykonywane niezależnie dla każdej analizy.
Precyzja jest wyznaczana w trzech etapach:
- Powtarzalność: precyzja jest wyznaczana przez jednego analityka dla tej samej próbki
w krótkim okresie czasu z wykorzystaniem tego samego instrumentarium. - Precyzja bezpośrednia: analizy tej samej próbki wykonywane w różne dni, przez różnych analityków z wykorzystaniem różnego instrumentarium w tym samym laboratorium
(jeśli to możliwe). - Odtwarzalność: precyzja wyznaczana na jednej próbce w różnych laboratoriach.
Wyznaczanie zarówno dokładności, jak i precyzji jest konieczne, jeśli chcemy mieć pewność, czy otrzymane wyniki są prawidłowe (Rys. 1).
W przypadku miareczkowania, dokładność oraz powtarzalność są zazwyczaj wyznaczane razem. Zaleca się co najmniej 2-3 oznaczenia, które powinny być wykonane na trzech różnych poziomach stężeń (łącznie od 6 do 9 oznaczeń). W przypadku analizy zawartości poleca się używanie naważki w zakresie od 80% do 120% w odniesieniu do zakładanej naważki próbki, która będzie używana
w trakcie właściwej analizy.
Liniowość
Liniowość dostarcza informacji czy dana metoda dostarcza prawidłowych wyników w zakładanym zakresie stężeń. Ponieważ miareczkowanie jest metodą absolutną, liniowość można określić bezpośrednio zmieniając naważkę próbki, a tym samym stężenie analitu.
W celu wyznaczenia liniowości metody miareczkowej w interesującym zakresie, poleca, się miareczkowanie przynajmniej 5 różnych naważek, a następnie sporządzenie wykresu regresji liniowej przedstawiającego objętość próbki w funkcji objętości titranta. Określenie liniowości metody odbywa się na podstawie współczynnika R2. Zaleca się, aby wielkość próbki mieściła się w zakresie od 80% do 120% w odniesieniu do zakładanej naważki próbki, która będzie używana
w trakcie właściwej analizy.
Specyficzność
Zanieczyszczenia, substancje pomocnicze, produkty degradacji to tylko niektóre z wielu związków, które mogą być obecne w matrycy próbki. Specyficzność to zdolność do oznaczenia analitu bez potencjalnych interferencji ze strony innych składników próbki. Dlatego też konieczne jest wykazanie, że inne związki obecne w próbce nie mają wpływu na przebieg procedury analitycznej. Ma to miejsce w przypadku, kiedy punkt równoważnikowy nie jest przesunięty pomimo dodatku zanieczyszczenia lub wypełniacza. Jeśli jednak takie przesunięcie punktu równoważnikowego występuje, to metodę uznaję się za specyficzną, kiedy składniki przeszkadzające mogą zostać jednoznacznie oznaczone przy użyciu określonego systemu detekcji, np. elektrody szklanej. .
Specyficzność może zostać osiągnięta przez używanie odpowiednich rozpuszczalników (np. miareczkowanie w układzie bezwodnym zamiast w układzie wodnym w przypadku miareczkowań alkacymetrycznych) lub miareczkowanie przy konkretnej wartości pH (np. kompleksometryczne miareczkowanie wapnia przy pH=12,w którym magnez strąca się jako wodorotlenek magnezu).
Jak to może być zastosowane w praktyce? Miareczkowanie KHCO3 przy użyciu HCl może posłużyć jako przykład. W tym przypadku K2CO3 jest traktowane jako zanieczyszczenie, z wartościami pKb na poziomie 8,3 oraz 3,89. Umożliwia to rozdzielenie dwóch składników podczas miareczkowania alkacymetrycznego.
Dolne krzywe miareczkowania odpowiadają roztworowi zawierającemu, zarówno KHCO3 jak i K2CO3. Dwa punkty równoważnikowe zostały wyznaczone: pierwszy odnosi się do dodanego K2CO3, podczas gdy drugi jest sumą KHCO3 oraz K2CO3. Górna krzywa przedstawia tylko jeden punkt równoważnikowy odpowiadający KHCO3 bez zanieczyszczeń.
Wnioski
Jeśli zastosujesz się do powyższych zaleceń, bez problemów zdołasz przeprowadzić walidację metody miareczkowej – to dobry czas, aby zacząć!
Używając automatycznego miareczkowania potencjometrycznego jesteś w stanie zwiększyć dokładność oraz powtarzalność uzyskiwanych wyników. Dodatkowo używanie automatycznego titratora pozwala na spełnienie wymagań w zakresie zgodności i integralności danych (https://www.metrohm.com/pl_pl/produkty/oprogramowanie-laboratoryjne-omnis.html)
Foto: Metrohm