Załóżmy, że dwa różne laboratoria walidują tę samą metodę badawczą. Oba chcą sprawdzić „poprawność metody”.
Pierwsze z laboratoriów posiada próbkę matrycową, którą wzbogaca znaną ilością wzorca i w toku późniejszej analizy sprawdza, ile z tego wzorca udaje się odzyskać.
Drugie laboratorium sięga po certyfikowany materiał odniesienia o znanej zawartości analitu, wykonuje jego analizę kilkukrotnie i porównuje średni wynik analizy z wartością certyfikowaną.
Obie procedury są metodycznie poprawne. Żadna z nich w teorii nie jest „lepsza”.
Problem polega na tym, że w praktyce laboratoryjnej te dwa podejścia, a więc odzysk (recovery) i błąd systematyczny (bias) bywają traktowane jak dwie nazwy tego samego zjawiska, między którymi wybiera się na zasadzie przyzwyczajenia, albo tego, że akurat w arkuszu Excel, który się posiada, był liczony jeden z tych parametrów.
A zatem nasuwa się pytanie: Którą z metod badania poprawności powinno się zastosować?
Przed podjęciem decyzji warto rozważyć, czy powyższe pytanie nie powinno raczej brzmieć: jakim materiałem dysponuję, aby zbadać potencjalnie generowany przez moje laboratorium błąd?
Odpowiadając sobie na tę zagadkę, tytuł tego artykułu przestanie być problemem, bo jak się okaże, obie metody służą tej samej ocenie poprawności metody, tylko z innego punktu wyjścia, i to dostępny materiał, a nie przyzwyczajenie, powinien rozstrzygać wybór.
Dwa punkty wyjścia, nie dwie szkoły myślenia
Z klasycznego punktu widzenia protokołu walidacji obie metody (odzysk oraz błąd systematyczny) odpowiadają na to samo pytanie: czy metoda systematycznie zawyża lub zaniża wynik, czyli jak bardzo średni z uzyskanych wyników odbiega od wartości prawdziwej?
Odzysk (recovery)
Odzysk zakłada, że laboratorium wzbogaca próbkę matrycową (albo czystą matrycę, jeśli ma do takowej dostęp) znaną ilością wzorca, a następnie sprawdza, ile z tej dodanej ilości udaje się faktycznie oznaczyć metodą, którą walidujemy lub weryfikujemy.
W przypadku odzysku wzbogacenie próbki matrycowej zawsze niesie ze sobą więcej informacji o samej metodzie analitycznej niż wzbogacenie czystego rozpuszczalnika, bo tylko matryca pozwala uchwycić efekty specyficzne dla realnej próbki (interferencje, straty przy ekstrakcji, wpływ innych składników).
Dane wejściowe do policzenia odzysku to zatem para „dodano X” / „wykryto Y”, a wynikiem działania jest bezwymiarowy procent odzysku, z natury już osadzony w skali wyśrodkowanej na 100 %, gdzie taki wynik oznacza brak obciążenia.
Oczywiście odzysk równy 100 % w praktyce niemal nigdy nie występuje, bo odchylenia wynikające ze strat analitu w przygotowaniu próbki, efektów matrycowych lub systematycznych błędów samej metody mają i muszą mieć wpływ na końcowy wynik.
I tak wartości poniżej 100 % wskazują na straty analitu (adsorpcja na szkle, brak pełnej ekstrakcji, parowanie), a wartości powyżej 100 % na dodatkowy sygnał z innego źródła (efekt matrycy, interferencja, zanieczyszczenie próbki ślepej). Z odzyskami powyżej 100 % często mamy do czynienia przy niskich stężeniach analitu, gdzie każdy dodatkowy czynnik (np. szum instrumentu czy niedoskonałość korekcji tła) dodatkowo „podbija” nam wynik.
Warto jednak pamiętać, że świeżo dodany wzorzec — nawet do prawdziwej matrycy — to nie to samo, co analit, który przebywa w tej matrycy od dawna: dopiero z czasem wiąże się z nią mocniej (wnika w jej mikrostrukturę, ulega częściowej sorpcji), przez co jest trudniejszy do wyekstrahowania. Dlatego w wymaganiach akredytacyjnych i branżowych wytycznych coraz częściej wybrzmiewa nacisk na materiały o „dojrzałym”, certyfikowanym składzie — czyli takie, w których producent świadomie dał analitowi czas na związanie się z matrycą, zanim przypisał mu wartość. To prowadzi nas wprost do drugiego podejścia.
Błąd systematyczny (bias)
Błąd systematyczny zakłada coś innego: laboratorium analizuje wprost materiał odniesienia, w którym wartość analitu jest z góry znana i certyfikowana przez niezależne źródło. Może to być CRM, próbka z rundy badań biegłości (PT), albo inny dowolny materiał o przypisanej wartości — i wcale nie musi to być materiał matrycowy.
Certyfikowany roztwór wzorcowy, zmierzony wprost i wielokrotnie, bez żadnego wzbogacania, to tak samo błąd systematyczny, bo o przynależności do tej kategorii decyduje brak etapu dodawania wzorca, a nie obecność (lub brak) matrycy. W tym wypadku dane wejściowe to surowe wyniki pomiarów, a w efekcie otrzymujemy bias wyrażony w tej samej jednostce, co sam pomiar (np. mg/L, mg/kg, %), z opcjonalnym przeliczeniem na wartość względną.
Warto przy tym zaznaczyć, że podział na „wzbogacenie i wynik w procentach” oraz „CRM i wynik w jednostkach pomiaru” to wygodna konwencja praktyczna, a nie ścisła definicja źródłowa: w literaturze (Eurachem, wspólne wytyczne IUPAC/ISO/AOAC) odzysk bywa liczony też wprost z CRM, jako stosunek wyniku do wartości certyfikowanej, a błąd systematyczny jest pojęciem nadrzędnym, dla którego wzbogacenie próbki to tylko jeden ze sposobów jego oszacowania — obok niego stosuje się też m.in. porównanie z metodą referencyjną albo dane z porównań międzylaboratoryjnych i badań biegłości (ILC/PT).
Na potrzeby tego artykułu skupiamy się jednak na dwóch podejściach najczęściej spotykanych w codziennej pracy akredytowanego laboratorium — wzbogacaniu próbki i analizie CRM — i przyjmujemy podział według obecności etapu dodawania wzorca, bo to on najlepiej oddaje różnicę widoczną w praktyce.
Certyfikowany materiał odniesienia niesie ze sobą jeszcze jeden element: własną niepewność, podaną wprost w certyfikacie jako niepewność rozszerzona (np. „13,4 ± 1,0 mg/kg, k = 2”). Aby świadomie uwzględnić ją w teście istotności, trzeba ją najpierw sprowadzić do niepewności standardowej (u = U / k, w tym przykładzie 0,5 mg/kg), a dopiero tak przeliczoną wartość dołożyć, obok niepewności standardowej średniej z serii pomiarów, do mianownika klasycznego testu t-Studenta, porównując uzyskaną statystykę z wartością krytyczną rozkładu t dla odpowiednio dobranej liczby stopni swobody.
To wciąż ten sam test t — tylko z mianownikiem uwzględniającym, metodą GUM, niepewność samego materiału odniesienia, a nie osobny wskaźnik statystyczny. Ściśle rzecz biorąc, wzorzec używany do wzbogacania w odzysku ma tę samą właściwość: jego przygotowanie (czystość związku, ważenie, rozcieńczenie) też wnosi swoją niepewność — tyle że przy CRM tę wartość odczytujemy z certyfikatu, a przy wzorcu do wzbogacenia trzeba jej samemu poszukać, więc w praktyce łatwiej o niej zapomnieć.
Warto jednak rozdzielić dwie rzeczy, które łatwo ze sobą pomylić: to, co trafia do mianownika testu, wpływa wyłącznie na wniosek o statystycznej istotności odchylenia, nie zmienia samej wartości bias ani jej niepewności, która (zgodnie z powszechnie przyjętym podejściem Eurachem) i tak trafia do budżetu niepewności metody, niezależnie od tego, czy dany wynik okaże się „istotny”, czy nie.
Nawet niewielkie odchylenie od wartości certyfikowanej, jeżeli test policzymy wyłącznie na rozrzucie własnej serii, może wyjść istotne statystycznie. Doliczenie niepewności certyfikatu bywa wtedy uczciwą korektą, pod warunkiem, że certyfikat rzeczywiście jest szeroki względem powtarzalności naszej metody. Przy wąskim, dobrze scharakteryzowanym materiale odniesienia mianownik testu prawie się nie zmieni, więc nie warto traktować tego mechanizmu jako sposobu na „uratowanie” wyniku. Jest to uczciwe przyznanie, że sama miara, względem której oceniamy metodę, też nie jest znana z nieskończoną precyzją.
Możemy więc podsumować to tak:
Odzysk pyta: ile z tego, co dodałem, faktycznie jestem w stanie wykryć?
Błąd systematyczny pyta: jak blisko wartości referencyjnej znajduje się wynik analizy materiału wykonanej w moim laboratorium?
Jeżeli laboratorium dysponuje obydwoma rodzajami materiału, oba badania warto wykonać. Nie po to, żeby ich wyniki zsumować w budżecie niepewności. Odzysk i błąd systematyczny opisują to samo zjawisko (systematyczny błąd metody), więc wliczenie obu jako osobnych składowych podwójnie policzyłoby ten sam efekt; do budżetu wybiera się zwykle jedną wartość, najlepiej dopasowaną do rutynowej matrycy laboratorium.
Wartość dwóch niezależnych eksperymentów leży gdzie indziej: gdy odzysk i błąd systematyczny są ze sobą zgodne, to wzajemne potwierdzenie zwiększa zaufanie do metody. Gdy się rozjeżdżają, np. odzysk świeżo dodanego wzorca wychodzi dobrze, a bias na certyfikowanym materiale ujawnia odchylenie — to sygnał, że metoda inaczej radzi sobie z analitem świeżo dodanym niż z analitem realnie związanym z matrycą. To właśnie ta rozbieżność, nie suma obu liczb, jest wtedy najważniejszym wnioskiem z badania.
Dwa narzędzia, jedno pytanie o poprawność
Odzysk i błąd systematyczny nie są dwoma konkurencyjnymi sposobami liczenia tej samej rzeczy — to dwa różne eksperymenty, wybierane w zależności od tego, jaki materiał laboratorium ma pod ręką, i czy zależy mu na sprawdzeniu metody na analicie świeżo dodanym, czy na analicie realnie związanym z matrycą.
Pierwszy wymaga czystego wzorca do wzbogacenia i jest szybszy, ale ocenia sytuację nieco łatwiejszą niż rzeczywista próbka.
Drugi wymaga gotowego materiału odniesienia o już znanej, certyfikowanej wartości i nie potrzebuje etapu wzbogacania — wystarczy wielokrotna analiza dostarczonego materiału. Gdy jest to dobrze przygotowany CRM matrycowy, mówi też więcej o tym, jak metoda poradzi sobie tam, gdzie faktycznie ma pracować.
Wybór między nimi nie jest więc wyłącznie kwestią dostępności — jest też decyzją o tym, jak twardego dowodu poprawności metody laboratorium potrzebuje.
Michał Wyskiel
analityk chemiczny z doświadczeniem w pracy w laboratoriach akredytowanych, którego zainteresowania koncentrują się na jakości wyników badań, walidacji metod oraz wykorzystaniu statystyki w pracy laboratoriów chemicznych i środowiskowych. Łączy doświadczenie z analizą instrumentalną i klasycznymi metodami analitycznymi z zainteresowaniem metrologią, statystyką i wymaganiami systemów jakości. Wierzący, że w analityce profesjonalizm mierzy się precyzją, a sukces – poprawnie oszacowaną niepewnością pomiaru.
Laboratoria w praktyce, edycja 5 – warsztaty z walidacji metod i oceny niepewności pomiaru.
Sprawdź: